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細胞成團和細胞出芽實驗

更新時間:2016-05-12   更新時間:2016-05-12   點擊次數(shù):4697次

導言

近幾年來,3Dthree dimensional)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)開始成為生物學研究新的研究方法。使用3D系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)能更好的模擬生物體內(nèi)的真實生理環(huán)境,而2D(傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng))細胞培養(yǎng)系統(tǒng)不能有效的模擬細胞在生物體內(nèi)的生理環(huán)境。3D細胞技術(shù)有很多種方法,使用多細胞形成的細胞團是其中主要的研究應(yīng)用之一。細胞團是微小的細胞聚集簇,可以用來研究3D情況下向外生長的情況(細胞出芽)。

 

一.實驗原理

目前有幾種方法可以用來生成細胞團。 所有方法的原理都是防止細胞貼壁,并且創(chuàng)造環(huán)境增強臨近細胞間的細胞外基質(zhì)的粘附。這里我們提供的是一個液體膠的形式來形成細胞團。這是一種形成細胞團的非常簡單的方法,有如下的優(yōu)勢

1)可以形成單個細胞團,并且易于用顯微鏡觀測;

2)易于換液,可以進行長時間的培養(yǎng);

3)這個方法操作簡單,不需要額外的設(shè)備就能完成。

簡單來講就是先在多孔板底部加入瓊脂糖,之后再加入細胞懸液。加入瓊脂糖不僅僅是提供了個疏水表面,細胞不會粘附,又提供了一個凹液面,細胞可以聚集在凹孔中,加大了細胞和細胞之間接觸的幾率,增強了細胞之間的粘附。

 

二.實驗材料

 

96孔板,平底(Corning 3370

血管生成載玻片(德國ibidi,81506)

1.5%瓊脂糖(SigmaA9539,使用PBS或者超純水配置)

胰酶

Matrigel

細胞培養(yǎng)基

 

三.成團實驗步驟

 

196孔板預處理

  • 配置1.5%瓊脂糖,保持配好的瓊脂糖為液體狀態(tài)
  • 96孔板每孔添加50μl配置好的1.5%瓊脂糖,室溫靜置20分鐘,待瓊脂糖冷卻固化。50μl瓊脂糖能剛好覆蓋96孔板單孔的底部,并且形成凹液面。
  • 96孔板的孔間加入無菌PBS,保證實驗的濕度

 

2.細胞成團

  • 按照日常方法準備細胞懸液
  • 根據(jù)試驗設(shè)計確定單孔需加入的細胞個數(shù),本例中,每孔加入500個細胞
  • 加入50-100μl的稀釋好的細胞懸液,保證每孔總液體體積(包括瓊脂糖)不超過200μl,每孔細胞數(shù)500
  • 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
  • 每天都要換液,注意在細胞成團過程中不能劇烈晃動培養(yǎng)板
  • 可以用相差顯微鏡觀察細胞成團情況(圖一)。

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                  圖一:不同細胞系的成團過程(每孔500個細胞),比例尺 200μm

 

四.出芽實驗及分析

 

實驗步驟:

 

  1. 準備基質(zhì)膠
  • 實驗前一天將Matrigel置于冰盒中,放入4C冰箱,使膠能過第二天緩慢融化。(注意:同樣要準備一些4。C預冷的槍頭用于吸取Matrigel
  • 開始實驗前,將Matrigel始終保持放在冰盒中。
  • 打開滅菌包裝,取出ibidi血光生成載玻片 µ-Slide Angiogenesis。
  • 每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

 

2.凝膠 

  • 蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
  • 準備一個10cm的培養(yǎng)皿,放入浸過水的紙巾,制成一個濕盒。
  • ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿蓋。
  • 將整個培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,靜置30分鐘左右,等待膠凝結(jié)。

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3.細胞出芽實驗及圖像分析

  • 將形成的細胞團吸出,置于凝固的膠平面上
  • 培養(yǎng)并使用顯微鏡采集出芽圖像
  • 采用圖像分析軟件采集細胞團面積,出芽覆蓋面積,出芽個數(shù)以及總出芽長度等數(shù)據(jù)。

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